神經(jīng)元PAS結(jié)構(gòu)域蛋白4（Npas4），也稱為Le PAS、NXF、PASD10、bHLHe79，是PER ARNT SIM（bHLH PAS）類轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子中的一員。Npas4由神經(jīng)元特異性即刻早期基因（IEG）Npas4編碼，該基因受到神經(jīng)元活動的強(qiáng)烈誘導(dǎo)。與cfos等傳統(tǒng)IEG不同，npas4對cAMP或神經(jīng)營養(yǎng)因子等旁分泌因子的刺激沒有反應(yīng)（Lin等人，2008）。此外，Npas4表達(dá)比其他IEG更快速、更短暫（Ramamoorthi等人，2011）。這種對神經(jīng)元活動的緊密調(diào)節(jié)使Npas4成為大腦中神經(jīng)元活動的理想標(biāo)志物。Activity Signaling 為神經(jīng)學(xué)研究供應(yīng)重組Npas4單抗，用于神經(jīng)元檢測研究。
      
NPAS4 背景簡介：

       神經(jīng)元活性參與信號通路，產(chǎn)生基因表達(dá)的改變，導(dǎo)致神經(jīng)元的長期適應(yīng)性變化，這種變化是行為可塑性的基礎(chǔ)。自從30多年前發(fā)現(xiàn)去極化作用可以驅(qū)動C-Fos基因的轉(zhuǎn)錄以來，關(guān)于興奮-轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)機(jī)制有大量研究。突觸傳遞過程中通過NMDA受體進(jìn)入的Ca²⁺離子和隨后去極化的L型電壓依賴性鈣通道充當(dāng)?shù)诙攀?，參與各種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，激活轉(zhuǎn)錄因子以驅(qū)動早期基因的轉(zhuǎn)錄。
      Fos、arc和egr1（zif268）等傳統(tǒng)IEG已被用作環(huán)境刺激驅(qū)動的神經(jīng)元活動的替代標(biāo)記，通過原位雜交、免疫染色或轉(zhuǎn)基因動物等技術(shù)鑒定最近活躍的神經(jīng)元。這些神經(jīng)元的功能重要性在最近的研究中得到了證明，這些研究利用fos的活性依賴性，在恐懼條件反射期間激活的神經(jīng)元群中表達(dá)基因編碼的光遺傳工具或設(shè)計藥物受體。隨后對這些神經(jīng)元群的人工激活足以模擬恐懼反應(yīng) 。
      雖然傳統(tǒng)的IEG在識別活動依賴性回路方面發(fā)揮了重要作用，但這些基因的表達(dá)可能并不完全適應(yīng)神經(jīng)元活動。傳統(tǒng)的IEG轉(zhuǎn)錄是對突觸活動和Ca2+進(jìn)入的反應(yīng)，也是對生長因子信號、神經(jīng)營養(yǎng)因子和神經(jīng)調(diào)節(jié)劑通過cAMP信號的反應(yīng)。
     
      相比之下，Michael Greenberg的實驗室表明，神經(jīng)元特異性IEG npas4是由神經(jīng)元活動強(qiáng)烈而迅速誘導(dǎo)的，但對旁分泌因子沒有反應(yīng)。這種對神經(jīng)元活動的緊密調(diào)節(jié)表明，Npas4可以成為神經(jīng)元活動的更特異的標(biāo)志物。
      為了尋找更多對npas4等活性進(jìn)行純調(diào)節(jié)的基因，我們對原代培養(yǎng)的小鼠皮質(zhì)神經(jīng)元進(jìn)行了RNA-Seq實驗，并比較了突觸活性或cAMP驅(qū)動的表達(dá)。
      
       傳統(tǒng)的IEGs被突觸活性和cAMP上調(diào)。正如預(yù)期的那樣，npas4被突觸活性上調(diào)。事實上，在檢測到的所有約15000個轉(zhuǎn)錄本中，npas4基因是誘導(dǎo)活性最高的，但正如Greenberg實驗室所預(yù)測的那樣，cAMP不會上調(diào)npas4。重要的是，沒有發(fā)現(xiàn)任何其他對神經(jīng)元活動表現(xiàn)出類似調(diào)節(jié)的基因。
為了研究體內(nèi)npas4的誘導(dǎo)，我們進(jìn)行了情境恐懼條件反射（cFC）實驗，并用qPCR和RNA-Seq測量了海馬和脾后皮質(zhì)（RSC）中的基因表達(dá)，這兩個腦區(qū)已知與學(xué)習(xí)和記憶有關(guān)。在這些實驗中，動物沒有習(xí)慣于恐懼條件反射箱，相對于小鼠居住籠的反應(yīng)代表了對編碼模塊，而不是恐懼記憶本身。訓(xùn)練后對fos、arc和npas4誘導(dǎo)的時間過程的檢查表明，兩個腦區(qū)的npas4 mRNA水平在1小時內(nèi)恢復(fù)到基線水平，而fos和arc表達(dá)在較長時間內(nèi)保持升高。
      為了研究體內(nèi)npas4的誘導(dǎo)，我們進(jìn)行了情境恐懼條件反射（cFC）實驗，并用qPCR和RNA-Seq測量了海馬和脾后皮質(zhì)（RSC）中的基因表達(dá)，這兩個腦區(qū)已知與學(xué)習(xí)和記憶有關(guān)。在這些實驗中，動物沒有習(xí)慣于恐懼條件反射箱，相對于小鼠居住籠的反應(yīng)代表了對編碼模塊，而不是恐懼記憶本身。訓(xùn)練后對fos、arc和npas4誘導(dǎo)的時間過程的檢查表明，兩個腦區(qū)的npas4 mRNA水平在1小時內(nèi)恢復(fù)到基線水平，而fos和arc表達(dá)在較長時間內(nèi)保持升高。
      
       這與Yingxi Lin實驗室的數(shù)據(jù)一致，該數(shù)據(jù)顯示，在cFC訓(xùn)練后，這三個基因的結(jié)果相似。此外，他們發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元中的急性npas4敲除阻止了fos、arc和zif268/egr1的誘導(dǎo)，這表明npas4是活性依賴性基因誘導(dǎo)的主要調(diào)節(jié)因子。
       為了證明脾后皮質(zhì)中的IEG誘導(dǎo)是由cFC期間NMDA受體的激活誘導(dǎo)的，我們進(jìn)行了實驗，將小鼠暴露于NMDAR拮抗劑MK-801或賦形劑對照溶液中。重要的是，盡管進(jìn)行了大量的預(yù)處理，但傳統(tǒng)的IEG如arc、fos和egr1在注射后仍增加了表達(dá)，這可能是由于經(jīng)驗導(dǎo)致的。
       
                    Figure 4: Npas4 does not respond to the stress of vehicle injection.
       有趣的是，載體注射后npas4沒有增加。所有IEG，包括對cFC的反應(yīng)，都增加了它們的表達(dá)。用MK-801阻斷NMDAR可以部分阻止傳統(tǒng)IEG表達(dá)的增加，而npas4的增加完全取決于NMDAR的激活。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明npas4對載體注射激活的途徑?jīng)]有反應(yīng)。相反，npas4對cFC有選擇性反應(yīng)，并提供更高保真的突觸活動讀數(shù)。
       上述數(shù)據(jù)充分表明，傳統(tǒng)IEG對神經(jīng)元活動本身以外的信號有反應(yīng)。另一個類似的發(fā)現(xiàn)來自對晝夜節(jié)律周期中IEG調(diào)節(jié)的研究。有趣的是，發(fā)現(xiàn)海馬體中傳統(tǒng)IEGs fos和arc的表達(dá)水平具有晝夜節(jié)律，在光暗周期內(nèi)一致波動，而npas4轉(zhuǎn)錄水平保持相對恒定。
        
       這些數(shù)據(jù)進(jìn)一步支持了除對環(huán)境線索的急性神經(jīng)元活動反應(yīng)之外的因素控制傳統(tǒng)IEG表達(dá)水平的觀點(diǎn)。
       最后，鑒于npas4相對于fos和其他傳統(tǒng)IEG的獨(dú)特調(diào)節(jié)，以及c-fos非常普遍用于標(biāo)記被認(rèn)為是“記憶痕跡”或“印跡”的活動依賴性神經(jīng)元集合的事實，我們想確定npas4和fos是否標(biāo)記了相同的神經(jīng)元群。為此，我們進(jìn)行了RNAScope原位雜交實驗，觀察cFC后的兩個轉(zhuǎn)錄本。在海馬體的齒狀回區(qū)域，發(fā)現(xiàn)了一個明顯重疊的最近激活的神經(jīng)元群。
      
     然而，在CA1區(qū)，我們看到不同神經(jīng)元群體的跡象可能用兩種不同的基因標(biāo)記。這些數(shù)據(jù)是初步的，不能用于得出明確的結(jié)論，但它們確實明確提出了僅依靠c-Fos來識別最近激活的神經(jīng)元系綜的問題，尤其是最近將c-Fos表達(dá)等同于“印跡細(xì)胞”的趨勢。
    NPAS4 抗體驗證：
    
圖1.去極化誘導(dǎo)Npas4在原代神經(jīng)元培養(yǎng)物中的表達(dá)。8次DIV后，通過用TTX阻斷動作電位或用KCl輕度去極化45分鐘來沉默原代培養(yǎng)的胚胎小鼠皮質(zhì)神經(jīng)元。輕度去極化利用Ca2+介導(dǎo)的信號機(jī)制誘導(dǎo)Npas4轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)表達(dá)。神經(jīng)元細(xì)胞體和樹突用Sigma的抗Map2-Ab（HM-2）標(biāo)記，Npas4用活性信號Npas4-Ab標(biāo)記。

圖2.分離小鼠海馬培養(yǎng)物中的抗體驗證。神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)的活動是通過阻斷GABAA受體拮抗劑Bicuulline的抑制性突觸傳遞來驅(qū)動的。A） 正如預(yù)期的那樣，在未刺激的培養(yǎng)物中，抗Npas4-Ab沒有出現(xiàn)免疫反應(yīng)性，而在驅(qū)動興奮性突觸活動后，可以看到強(qiáng)烈的信號。B） 在未刺激的對照培養(yǎng)物中，不存在Npas4免疫反應(yīng)性，然而，AAV感染后小鼠Npas4的過表達(dá)導(dǎo)致Npas4條帶突出。
產(chǎn)品訂購：
神經(jīng)元PAS結(jié)構(gòu)域蛋白4（Npas4），也稱為Le PAS、NXF、PASD10、bHLHe79，是PER ARNT SIM（bHLH PAS）類轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子中的一員。Npas4由神經(jīng)元特異性即刻早期基因（IEG）Npas4編碼，該基因受到神經(jīng)元活動的強(qiáng)烈誘導(dǎo)。與cfos等傳統(tǒng)IEG不同，npas4對cAMP或神經(jīng)營養(yǎng)因子等旁分泌因子的刺激沒有反應(yīng)（Lin等人，2008）。此外，Npas4表達(dá)比其他IEG更快速、更短暫（Ramamoorthi等人，2011）。這種對神經(jīng)元活動的緊密調(diào)節(jié)使Npas4成為大腦中神經(jīng)元活動的理想標(biāo)志物。
 

品牌	Activity Signaling
產(chǎn)品名稱	Recombinant anti Npas4 Rabbit Mab
貨號	AS-AB18A-100/AS-AB18A-300
規(guī)格	100ul/300ul
靈敏度/特異性	通過原代神經(jīng)元的免疫細(xì)胞化學(xué)、腦切片的免疫組織化學(xué)和蛋白質(zhì)印跡評估，這種抗Npas4抗體具有最小的非特異性背景結(jié)合。此外，npas4-KO小鼠的免疫反應(yīng)性完全喪失。小鼠睪丸的免疫反應(yīng)性已經(jīng)得到證實。未在其他物種中進(jìn)行測試。
抗體濃度	1mg/ml (無菌PBS),100ul
產(chǎn)品應(yīng)用	建議神經(jīng)元染色，免疫組化、Western Blot工作濃度起始濃度1:500-1:2000。最佳稀釋比根據(jù)實驗具體優(yōu)化確定。
產(chǎn)品保存	冰塊運(yùn)輸，短期4℃保存，長期-20℃分裝凍存。

 
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